基因治疗制造趋势：用高产能、可放大的固定床生物反应器加速基因治疗的工业化生产
本文节选自《Gene Therapy Manufacturing Trends》，详细内容，请参考原文。
基因和基因修饰细胞疗法是生物制药市场增长最快的领域之一。这些新药物即使不能完全治愈曾经被认为是无法治愈的疾病，也极有可能缓和这些疾病的影响。已有多家公司在临床试验和市场上取得了成功，而更多大大小小的开发商正在吸引大量的投资，旨在加速其产品审批和商业化进程。
事实上，根据再生医学联盟的数据，尽管出现了COVID-19大流行，但2020年用于再生药物和先进疗法的资金达到了创纪录的199亿美元，其中基因疗法的资金增长了73%。在全球范围内活跃的、基于组织的治疗方法进行了超过1,200项临床试验(比前一年多约100项)，其中31.5%处于I期，56%处于II期，12.5%处于III期。
另外，有两项基因疗法在2020年获得批准：Orchard Therapeutics的基因疗法Libmeldy获得了欧洲药品管理局(EMA)的批准，Kite Pharma的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法获得了美国食品药品管理局(FDA)的批准。预计2021年将针对8种新的再生药物产品作出8项额外的监管决定。
早在2019年，FDA就曾预计，其每年将收到超过200个细胞和基因疗法的研究性新药申请，到2025年，每年将有10到20个细胞和基因疗法产品获得批准。
工艺即产品
然而，监管部门正在密切关注基因和细胞治疗的生产，因为正如人们经常指出的那样，“工艺即产品”。基因和基因修饰细胞疗法是利用病毒载体生产的。对于基因疗法来说，载体就是疗法，作为目的基因的传递工具，前者将用于取代缺失或功能失调的基因。在基因修饰细胞治疗中，例如CAR- T细胞治疗，病毒载体被用来将遗传物质递送到细胞中，以某种方式对其进行改造，从而增强或提高生物活性。
最常用的病毒载体是腺相关病毒(AAV)和慢病毒(LV)，但腺病毒和一些逆转录病毒也被用于基因和基因修饰细胞治疗候选疗法临床管线。
这些病毒载体是通过细胞培养产生的，通常是用质粒DNA转染哺乳动物细胞(典型为HEK293)，但在某些情况下(如AAV)是通过同时感染杆状病毒昆虫细胞体系，或使用人类来源的单纯疱疹病毒(HSV) 1型系统。
更稳定的包装和生产细胞系已经开发并在某些情况下使用，但这些解决方案需要更长的开发时间，需要显著的更多优化工作，才能被更高广泛地使用。
对于基因疗法来说，需要最大限度地缩短进入临床试验的时间，而更重要的是缩短进入市场的时间，因为第一个推出的产品将主导市场；与单克隆抗体不同的是，后来者获得市场份额的机会更低。
因此，最初的重点是展示药物疗效，而不是工艺效率、稳健性和可放大性。事实上，许多最初在实验室规模上通过静态塑料器皿开发的基因治疗方法，足以用于发现工作，甚至用于早期临床试验物料的生产。然而，它们通常需要大量的手动操作，不适合大规模使用。
最初专注于悬浮细胞培养
大多数基因疗法，包括今天正在发展当中的那些，开始使用贴壁细胞培养工艺，尽管对于临床前阶段来说，贴壁细胞复杂且昂贵，但其提供了一种快速发现、开发和进入临床的手段。
然而，重组蛋白和单克隆抗体(mAb)的传统生物制造工艺是在搅拌罐反应器(STR)的悬浮进行的。这些反应器最初被开发用于化学工业，然后被用于酿造，最后被用于生物制品的生产。对于mAb，其提供了许多优点，包括可放大性以及众所周知的流体动力学行为，这允许实现自动控制和高水平的再现性。在过去的几十年里，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞在悬浮细胞培养中表现良好，提供了稳健且高产的细胞系，能够产生比初始细胞系显著更高的滴度。
用于悬浮细胞培养工艺的STR越来越多地使用一次性使用系统，且其可以很容易地实现从mL到6,000 L或更大的规模。接种液首先在摇瓶中制备，然后在较小的生物反应器中以10倍每步的步骤提高接种液的体积，直到获得所需的接种量。
搅拌罐生物反应器的局限性
然而，STR悬浮细胞培养在病毒载体生产方面存在局限性。任何类型的细胞培养都需要适当的浓度，以便通过分泌和吸收各种辅助因子使细胞之间能够“交流”。由于STR中的浓度效应，生产性生物反应器必须在高浓度下接种 - 比最初的贴壁工艺要高得多 – 这会带来额外的时间和成本。
悬浮细胞是由贴壁细胞“改造”而来的。由于它们不是在它们的自然状态，它们的行为方式不同，而且往往比它们的贴壁“同行”提供更低的产量。HEK293细胞适应悬液的工作只进行了几年，而不是几十年，因此，它们在大规模生产时往往不那么“健壮”，因此在规模放大方面仍然存在许多挑战。
用质粒DNA转染HEK293细胞需要均匀混合才能有效，但在大型STR内实现均匀混合是困难的，因为混合效率随规模扩大而降低。搅拌和气体流动速率(氧气鼓泡，导致大的、分散气泡的存在)必须非线性地增加，以计入罐总体积 (m3) 与可用于热和气体传输的表面(m2)之比的增加。更高的搅拌意味着更高的机械力和更高的局部氧化应激风险。
用于病毒载体生产的哺乳动物细胞对这些在大型STR中普遍存在的剪切和氧化应激敏感。剪切应力也会破坏质粒DNA和质粒DNA-转染剂复合物，从而在泵送和实际工艺中需要注意。
剪切应力和氧化应激都对会这一过程产生负面影响。这通常需要更多的开发工作来将悬浮病毒载体工艺从实验室转移到中试工厂，再转移到商业化生产，而产量通常还仍不是最优的。
此外，典型的实验室规模转染工艺需要重复清洗转染混合物。这在STR的大规模悬浮工艺中是不可行的，因为它将需要处理成百上千升的液体。为了避免这个问题，要么通过过滤方法浓缩细胞，要么不清洗直接将转染混合物加入细胞培养中 - 这两种方法都会增加时间和成本。
行业对使用灌流细胞培养作为维持更长的细胞培养时间、而达到更高产量的手段的兴趣正在增加。在STR中，灌流需要使用外部细胞截留装置，但需要选择低剪切的技术，以降低对细胞的应激。（相关阅读：灌流中，ATF平均剪切低于TFF：低剪切提高重组蛋白生产，高剪切增加细胞凋亡）
固定床生物反应器中的贴壁细胞培养
在固定床反应器(FBR)中进行的贴壁细胞培养提供了一种替代在STR中进行悬浮培养的方式。固定在“床”上的细胞与液体培养基“分离”，允许在不影响细胞的情况下优化工艺参数。具体来说，FBR包含一个固体但可渗透的支持基质，促进贴壁细胞的均匀分布，并在最小的机械或氧化应力下，温和循环或灌流培养基，促使FBR获得更高的生长和生产力。
与STR相比，固定床的设计支持几乎相同的细胞数量和产量，而体积减少了100倍。更小的体积意味着更紧凑的占地面积，50 L FBR的产量相当于1,000 L或更大的STR。
FBR中更高的细胞密度也大大减少了所需的接种数量，从而降低了种子生产的操作负担。由于细胞被“床”自然截留，FBR也可实现灌流工艺，因为不需要复杂的细胞截留装置，这降低了工艺的复杂性和成本，同时也降低了细胞暴露于剪切应激的可能性。
此外，罐体积与气体和热交换表面的比例在规模放大或缩小时变化不大，即更容易维持罐内的均匀状态。这一特性也简化了转染过程，可以直接从小规模转移到大规模，而不需要细胞浓缩、稀释或重新开发转染混合物。
FBR的这一特性可方便利用一次性使用技术以及高水平的自动化和控制，实现了从实验室到工业规模的线性可放大性，从而在降低风险的情况下实现更快速的开发和商业化。
值得注意的是，在贴壁FBR工艺中，接种液的制备首先是在扁平培养容器中进行，然后在多层培养容器中放大。当产量足够多时，细胞酶解分离，以接种FBR。为了促进细胞在整个固定床上的均匀分布，必须确保细胞作为单个单元存在。如果剪切敏感型病毒载体为胞外生产，应特别小心，因其生产后将在FBR中循环。
FBR在载体制造中的应用
Univercells Technologies开发了scale-X FBR产品组合，以方便现有贴壁工艺的转移和缩放。scale-X hydro (2.4 m2)、scale-X carbo(10-30 m2)和scale-X nitro(200-600 m2)分别支持基因和基因修饰细胞疗法的工艺开发、中试规模、中 - 大规模工业生产和大规模工业生产。scale-X生物反应器产品也被证明适用于基于悬浮的工艺。在这种情况下，悬浮细胞被捕获在固定床中，从而可以在不影响工艺质量或生产率的情况下，从基于悬浮的工艺直接转移到scale-X FBR。
这种设计的结果是在与静态塑料器皿类似的条件下，实现培养基在细胞间的温和循环。一个紧密排列的支撑矩阵由卷式无纺布聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)织物层组成，允许在小占地的生物反应器中实现高细胞密度。磁性离心叶轮可提供良好混合，以确保整个固定床中营养物的可用性，系统通过罐顶部空间的“降膜”通气，以提高可用于气体交换的表面积，并在垂直和水平两个方向实现一致的环境。
液体培养基通过固定床的线速度在不同规模上保持不变，因此，细胞经历类似的低剪切条件。自动化程度高的同时，保证了关键工艺参数的控制。
满足大规模病毒载体制造需求
搅拌罐生物反应器的基本力学和操作约束可能导致工艺开发时间的延长，并影响生产率、效率和成本。虽然悬浮细胞培养被广泛用于生产病毒载体，但要实现真正的工业化，还需要更可靠、可放大的解决方案。随着贴壁工艺和悬浮工艺的不断进步，支持这两种方法的平台将通过分离工艺和技术来优化生产率和响应时间。
固定床生物反应器中的细胞培养为大规模生产病毒载体提供了解决方案，并将在促进大量低成本基因和基因修饰细胞疗法的制造方面发挥关键作用。使用scale-X FBR，早期开发工艺可以使用更简单的流程，直接转移到占地面积更小的一次性使用设备中，并获得更高的生产率和产量。
此外，最近正在进行的关于scale-X FBR在悬浮细胞培养中用于病毒载体制造的适用性的研究表明，这种一次性使用生物反应器技术也为利用悬浮工艺的基因治疗开发商提供了好处。具体数据将很快公布。
原文：A.Chatel, Gene Therapy Manufacturing Trends. Contract Pharma, 2021.
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